人-肠道肿瘤组织细胞悬液制备流程

注 | 以上操作指南中涉及的消化酶以及实验方法仅供参考，实际应用过程中请根据具体情况进行细节上的调整。

背景介绍

肠道肿瘤是发生于小肠和大肠的良性﹑恶性肿瘤。临床表现因肿瘤发生的性质和部位而异。一般来说﹐良性肿瘤可无症状或症状很轻。有的恶性肿瘤早期也无明显症状﹐从而影响诊断﹑治疗和预后。肠道肿瘤中﹐小肠肿瘤的发病率较食管﹑胃和大肠等部位为低。通过X射线造影﹑消化道内窥镜检查和活组织检查等方法可确诊。治疗宜手术切除。良性肿瘤预后好。肿瘤细胞与其同源正常组织相比，细胞间的粘着性降低，故肿瘤细胞在体内容易分散和转移。我们使用美天妮公司的人肿瘤组织分离试剂盒对肠道肿瘤进行解离。

人肠道肿瘤组织示意图

实验试剂及耗材

实验步骤

1. 准备肿瘤解离试剂盒的酶混合液，将100 µL的H酶、500 µL的R酶和25 µL的A酶加入到4.4mL的的 RPMI 1640培养基中。
2. 组织切成直径2-4 mm的小块。
3. 将组织转移到含有酶液的温和MACS C管中（冰上）。
4. 拧紧C管，并将其倒挂在gentle MACS Dissociator的套管上。
5. 运行 gentleMACS 中的 h_Tumor_01程序。
6. 程序终止后，将C管从gentleMACS解离器上拆下。
7. 使用MACSmix试管旋转器在37℃下连续旋转培养样品30 min。
8. 将C管倒挂在gentle MACS Dissociator的套筒上，并运行gentle MACS解离器的程序h_Tumor_02，随后将C管置于MACSmix试管旋转器上在37 ℃下连续旋转培养样品30 min。
9. 程序终止后，将C管从gentleMACS解离器上拆下。
10. 重悬细胞沉淀，使用置于50 mL离心管上的70 μm滤膜过滤。
11. 用20 mL RPMI 1640冲洗滤膜，300 xg离心7 min。完全吸出上清液。
12. 使用适当体积的缓冲液重悬细胞，使用台盼蓝血细胞计数仪分析细胞数量和活性。

结果

细胞量：95万左右，活率92%以上，结团率15%

注：肠肿瘤组织在解离的时候，若细胞量足够，尽可能做去除死细胞，以避免线粒体比例过高的情况。